Northstar Response™ - Eine neue Technologie zur Überwachung des Ansprechens auf die Krebstherapie

Ein neuer Assay, Northstar Response, verwendet die Molekülzählung, um methylierte zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) zur Überwachung des Ansprechens auf tumornaive Krebstherapien präzise zu quantifizieren. Der Multiplex-Assay zielt auf über 500 genomische Positionen ab, die in Krebs hypermethyliert sind, und verwendet quantitative Zählvorlagen (QCTs), um die Anzahl der methylierten Moleküle an jeder Position zu zählen. Die analytische Validierung zeigte eine genaue Erkennung von absoluten Veränderungen von 0,25 % in der Tumorfraktion (AUC > 0,94) und eine hohe Genauigkeit über 12 Tumor-Gewebetypen hinweg. Der Assay korreliert mit tumornaiven, zielgerichteten Panel-Methoden zur Messung der varianten Allelfraktion (VAF) und ist bis zu zweimal präziser als diese, wobei Variationskoeffizienten (CVs) < 10 % in Proben mit 1 % Tumoranteil erreicht werden. Es wurde eine hohe Übereinstimmung zwischen klinischen Ergebnissen und Northstar Response-Methylierungsmessungen beobachtet. Der Assay verwendet einen Amplikon-basierten Multiplex-PCR-Ansatz mit QCTs und Next-Generation-Sequenzierung (NGS), um methylierte Moleküle an über 500 genomischen Positionen zu zählen, die in Krebsgewebe hypermethyliert sind. Die Daten des Cancer Genome Atlas (TCGA) wurden analysiert, um diese hypermethylierten Positionen zu identifizieren. Der Assay zielt auf CpG-Inseln ab, DNA-Bereiche, in denen auf ein Cytosin-Nukleotid ein Guanin-Nukleotid in der DNA-Sequenz folgt, die bekanntermaßen in verschiedenen Krebsarten hypermethyliert sind. Theoretische Assay-Rauschberechnungen ergaben, dass die Probenahme von mindestens 1.000 methylierten Molekülen einen CV von 3 % erreichen würde, was eine genaue Erkennung von relativen Veränderungen von 10 % in der Tumorfraktion ermöglicht. Das Assay-Design erfordert etwa 500 Loci, um diesen CV zu erreichen. Die Ziel-CpG-Stellen sind in mehreren Krebsarten hypermethyliert, und simulierte Messungen zeigten eine signifikant erhöhte Methylierung in Krebs im Vergleich zu normalem Gewebe. Die genomischen Positionen, die im Assay abgedeckt werden, sind an der Krebsbiologie beteiligt. Der Assay zielt auf Gene mit DNA-bindender Transkriptionsfaktoraktivität und Homeobox-Gene ab, die an Entwicklungsprozessen und Onkogenität beteiligt sind. Die ausgewählten Loci sind mit Genen angereichert, die an Entwicklung, Morphogenese und Zelldifferenzierung beteiligt sind. QCTs werden verwendet, um die Anzahl der eingegebenen methylierten Moleküle an jedem Locus zu berechnen, wobei die Amplifikationsverzerrung berücksichtigt wird. Jede QCT enthält eine eingebettete molekulare Kennung (EMI) mit elf zufälligen Nukleotiden, die die Einzigartigkeit jedes QCT-Moleküls gewährleistet. Reads, die jedem Amplikon zugeordnet sind, werden basierend auf der Anzahl der CpGs als methyliert klassifiziert, und die Gesamtzahl der methylierten Reads wird durch die Reads pro Molekül dividiert, um die Anzahl der methylierten Probenmoleküle an diesem Amplikon vor der PCR zu berechnen. Die nicht-krebsbedingte Hintergrundmethylierung wird berücksichtigt, indem die Anzahl der methylierten Moleküle, die im Buffy Coat (weiße Blutzellfraktion des Blutes) gemessen werden, von der Anzahl der im gepaarten cfDNA gemessenen Moleküle pro Locus subtrahiert wird. Normalisierungsloci, die auf CpG-Stellen abzielen, die in allen Geweben stark methyliert sind, werden verwendet, um die Gesamtmenge der eingegebenen DNA zu schätzen. Nach der Quantifizierung der Anzahl der methylierten Moleküle, der Normalisierung auf eine Eingabe von 1.000 Genomäquivalenten (GE) DNA und der Subtraktion des Hintergrundsignals werden die normalisierten Molekülzahlen über die Loci summiert, um den Tumor-Methylierungs-Score zu berechnen. Technische Replikate von konstruierten Proben, die aus geschredderter Tumor-DNA hergestellt wurden, die in geschredderte Buffy-Coat-DNA bei verschiedenen Tumoranteilen eingebracht wurde, wurden getestet. Der Tumor-Methylierungs-Score stieg linear mit dem konstruierten Tumoranteil an und quantifizierte die methylierte Tumor-DNA genau. Der CV des Tumor-Methylierungs-Scores betrug < 20 % für alle konstruierten Tumoranteile. Die Fähigkeit des Assays, zwischen verschiedenen konstruierten Tumoranteilen zu unterscheiden, wurde mithilfe von Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven bewertet. Der Assay erkannte Veränderungen im Tumor-Methylierungs-Score mit hoher Sensitivität und Spezifität genau. Der Assay konnte mit einer Genauigkeit von nahezu 100 % unterscheiden, ob eine Abnahme auf 0,5 % Tumoranteil oder keine Veränderung des Tumoranteils vorlag. Die Präzision des Northstar Response-Assays wurde mit tumornaiven VAF-basierten Überwachungsansätzen verglichen. Der CV des Tumor-Methylierungs-Scores war niedriger als der mediane CV und der simulierte CV des mittleren VAF bei allen getesteten VAF-Tumoranteilsbereichen. Northstar Response erreichte CVs, die doppelt so niedrig waren wie die mit durchschnittlichen VAFs mit dem tumornaiven, zielgerichteten Panel-Assay gemessenen. Die Leistung des Assays wurde an 54 soliden Tumoren getestet, die aus 12 verschiedenen Geweben stammen. Tumor-Methylierungs-Scores bei 1 % und 2 % Tumoranteil wurden für jeden Tumor berechnet. Der Assay erkannte relative Zunahmen von 1 bis 2 % konstruiertem Tumoranteil bei einzelnen Patienten genau. Von Krebspatienten vor und nach der Behandlung entnommene Proben wurden getestet. Tumor-Methylierungs-Scores zeigten eine hohe Übereinstimmung mit klinischen Ergebnissen. Alle sieben Patienten zeigten nach Beginn der Behandlung eine anfängliche Abnahme des Tumor-Methylierungs-Scores. Veränderungen der Tumor-Methylierungs-Scores spiegelten die Dynamik der Krebsbehandlung wider.