Новый анализ Northstar Response™ использует подсчет молекул для точного количественного определения метилированной циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) для мониторинга ответа на терапию рака у пациентов, ранее не получавших лечения.
Мультиплексный анализ нацелен на более чем 500 геномных локаций, гиперметилированных при раке, с использованием количественных шаблонов подсчета (QCT) для подсчета метилированных молекул в каждой локации. Аналитическая валидация показала точное обнаружение абсолютных изменений на 0,25% в опухолевой фракции (AUC > 0,94) и высокую точность в 12 типах опухолевых тканей. Анализ коррелирует до двух раз точнее, чем методы таргетной панели без предварительной обработки опухоли, измеряющие фракцию вариантных аллелей (VAF), достигая коэффициентов вариации (CV) < 10% в образцах с опухолевой фракцией 1%. Наблюдалось высокое соответствие между клиническими исходами и измерениями метилирования Northstar Response. В анализе используется мультиплексный ПЦР-подход на основе ампликонов с QCT и секвенированием нового поколения (NGS) для подсчета метилированных молекул в более чем 500 геномных локациях, гиперметилированных в раковой ткани. Данные The Cancer Genome Atlas (TCGA) были проанализированы для выявления этих гиперметилированных локаций. Анализ нацелен на CpG-островки, участки ДНК, где за нуклеотидом цитозина следует нуклеотид гуанина в последовательности ДНК, которые, как известно, гиперметилированы при различных видах рака. Теоретические расчеты шума анализа показали, что отбор проб как минимум 1000 метилированных молекул позволит достичь CV в 3%, что позволит точно обнаруживать относительные изменения на 10% в опухолевой фракции. Для достижения этого CV конструкция анализа требует примерно 500 локусов. Целевые CpG-сайты гиперметилированы при нескольких типах рака, а смоделированные измерения показали значительно повышенное метилирование при раке по сравнению с нормальной тканью. Геномные локации, охваченные анализом, вовлечены в биологию рака. Анализ нацелен на гены с активностью фактора транскрипции, связывающего ДНК, и гены homeobox, которые участвуют в процессах развития и онкогенности. Выбранные локусы обогащены генами, участвующими в развитии, морфогенезе и дифференцировке клеток. QCT используются для расчета количества введенных метилированных молекул в каждом локусе с учетом смещения амплификации. Каждый QCT содержит встроенный молекулярный идентификатор (EMI) с одиннадцатью случайными нуклеотидами, что обеспечивает уникальность каждой молекулы QCT. Прочтения, соответствующие каждому ампликону, классифицируются как метилированные на основе количества CpG, а общее количество метилированных прочтений делится на количество прочтений на молекулу для расчета количества метилированных молекул образца в этом ампликоне до ПЦР. Нераковое фоновое метилирование учитывается путем вычитания количества метилированных молекул, измеренных в лейкоцитарном слое (фракция лейкоцитов крови), из измеренного в парной cfDNA на основе каждого локуса. Локусы нормализации, нацеленные на CpG-сайты, сильно метилированные во всех тканях, используются для оценки общего количества введенной ДНК. После количественного определения количества метилированных молекул, нормализации до ввода 1000 геномных эквивалентов (GE) ДНК и вычитания фонового сигнала нормализованные количества молекул суммируются по локусам для расчета оценки метилирования опухоли. Были протестированы технические реплики искусственных образцов, изготовленных из фрагментированной опухолевой ДНК, добавленной во фрагментированную ДНК лейкоцитарного слоя в различных опухолевых фракциях. Оценка метилирования опухоли линейно увеличивалась с искусственной опухолевой фракцией, точно количественно определяя метилированную опухолевую ДНК. CV оценки метилирования опухоли составлял < 20% для всех искусственных опухолевых фракций. Способность анализа различать различные искусственные опухолевые фракции оценивалась с использованием кривых рабочих характеристик приемника (ROC). Анализ точно определял изменения в оценке метилирования опухоли с высокой чувствительностью и специфичностью. Анализ смог различить, было ли снижение до 0,5% опухолевой фракции или не было изменений в опухолевой фракции с точностью, приближающейся к 100%. Точность анализа Northstar Response сравнивалась с подходами мониторинга на основе VAF без предварительной обработки опухоли. CV оценки метилирования опухоли был ниже, чем медианный CV и смоделированный CV средней VAF во всех протестированных диапазонах опухолевой фракции VAF. Northstar Response достиг CV в два раза ниже, чем измеренные с использованием средних VAF с анализом таргетной панели без предварительной обработки опухоли. Производительность анализа была протестирована на 54 солидных опухолях, происходящих из 12 различных тканей. Оценки метилирования опухоли при 1% и 2% опухолевой фракции были рассчитаны для каждой опухоли. Анализ точно определял относительное увеличение от 1 до 2% искусственной опухолевой фракции у отдельных пациентов. Были протестированы образцы пациентов с раком, собранные до и после лечения. Оценки метилирования опухоли показали высокую согласованность с клиническими исходами. У всех семи пациентов наблюдалось начальное снижение оценки метилирования опухоли после начала лечения. Изменения в оценках метилирования опухоли отражали динамику лечения рака.