Northstar Response™: Una Nueva Tecnología para Monitorear la Respuesta a la Terapia contra el Cáncer

Un nuevo ensayo, Northstar Response, utiliza el conteo de moléculas para cuantificar con precisión el ADN tumoral circulante (ADNct) metilado para el seguimiento de la respuesta a la terapia contra el cáncer en pacientes sin tratamiento previo. El ensayo multiplex se dirige a más de 500 ubicaciones genómicas hipermetiladas en el cáncer, utilizando plantillas de conteo cuantitativo (QCT) para contar las moléculas metiladas en cada ubicación. La validación analítica mostró una detección precisa de cambios absolutos del 0,25% en la fracción tumoral (AUC > 0,94) y una alta precisión en 12 tipos de tejidos tumorales. El ensayo se correlaciona y es hasta dos veces más preciso que los métodos de panel dirigidos sin tratamiento previo que miden la fracción de alelos variantes (VAF), alcanzando coeficientes de variación (CV) < 10% en muestras con una fracción tumoral del 1%. Se observó una alta concordancia entre los resultados clínicos y las mediciones de metilación de Northstar Response. El ensayo emplea un enfoque de PCR multiplex basado en amplicones con QCT y secuenciación de nueva generación (NGS) para contar las moléculas metiladas en más de 500 ubicaciones genómicas hipermetiladas en el tejido canceroso. Se analizaron los datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) para identificar estas ubicaciones hipermetiladas. El ensayo se dirige a las islas CpG, regiones del ADN donde un nucleótido de citosina es seguido por un nucleótido de guanina en la secuencia del ADN, que se sabe que están hipermetiladas en varios tipos de cáncer. Los cálculos teóricos del ruido del ensayo determinaron que el muestreo de al menos 1000 moléculas metiladas lograría un CV del 3%, lo que permitiría una detección precisa de cambios relativos del 10% en la fracción tumoral. El diseño del ensayo requiere aproximadamente 500 loci para lograr este CV. Los sitios CpG objetivo están hipermetilados en múltiples tipos de cáncer, y las mediciones simuladas mostraron un aumento significativo de la metilación en el cáncer en comparación con el tejido normal. Las ubicaciones genómicas cubiertas en el ensayo están implicadas en la biología del cáncer. El ensayo se dirige a genes con actividad de factor de transcripción de unión al ADN y genes homeobox, que están involucrados en procesos de desarrollo y oncogenicidad. Los loci seleccionados están enriquecidos para genes involucrados en el desarrollo, la morfogénesis y la diferenciación celular. Se utilizan QCT para calcular el número de moléculas metiladas de entrada en cada locus, teniendo en cuenta el sesgo de amplificación. Cada QCT contiene un identificador molecular integrado (EMI) con once nucleótidos aleatorios, lo que garantiza la singularidad de cada molécula QCT. Las lecturas que se asignan a cada amplicón se clasifican como metiladas en función del número de CpG, y el número total de lecturas metiladas se divide por las lecturas por molécula para calcular el número de moléculas de muestra metiladas en este amplicón antes de la PCR. La metilación de fondo no cancerosa se tiene en cuenta restando el número de moléculas metiladas medidas en el buffy coat (fracción de glóbulos blancos de la sangre) de las medidas en el ADNcf emparejado en una base por locus. Los loci de normalización, que se dirigen a los sitios CpG altamente metilados en todos los tejidos, se utilizan para estimar la cantidad total de ADN de entrada. Después de cuantificar el número de moléculas metiladas, normalizar a una entrada de 1000 equivalentes de genoma (GE) de ADN y restar la señal de fondo, los recuentos de moléculas normalizados se suman a través de los loci para calcular la puntuación de metilación tumoral. Se probaron réplicas técnicas de muestras artificiales, hechas de ADN tumoral fragmentado añadido a ADN de buffy coat fragmentado en varias fracciones tumorales. La puntuación de metilación tumoral aumentó linealmente con la fracción tumoral artificial, cuantificando con precisión el ADN tumoral metilado. El CV de la puntuación de metilación tumoral fue < 20% para todas las fracciones tumorales artificiales. La capacidad del ensayo para distinguir entre diferentes fracciones tumorales artificiales se evaluó utilizando curvas de características operativas del receptor (ROC). El ensayo identificó con precisión los cambios en la puntuación de metilación tumoral con alta sensibilidad y especificidad. El ensayo pudo distinguir si hubo una disminución al 0,5% de la fracción tumoral o ningún cambio en la fracción tumoral con una precisión que se aproxima al 100%. La precisión del ensayo Northstar Response se comparó con los enfoques de seguimiento basados en VAF sin tratamiento previo. El CV de la puntuación de metilación tumoral fue menor que el CV medio y el CV simulado de la VAF media en todos los rangos de fracción tumoral VAF probados. Northstar Response logró CV dos veces más bajos que los medidos utilizando VAF promedio con el ensayo de panel dirigido sin tratamiento previo. El rendimiento del ensayo se probó en 54 tumores sólidos originarios de 12 tejidos diferentes. Se calcularon las puntuaciones de metilación tumoral al 1% y al 2% de la fracción tumoral para cada tumor. El ensayo identificó con precisión los aumentos relativos del 1 al 2% de la fracción tumoral artificial en pacientes individuales. Se probaron muestras de pacientes con cáncer recolectadas antes y después del tratamiento. Las puntuaciones de metilación tumoral mostraron una alta concordancia con los resultados clínicos. Los siete pacientes tuvieron una disminución inicial en la puntuación de metilación tumoral después de comenzar el tratamiento. Los cambios en las puntuaciones de metilación tumoral reflejaron la dinámica del tratamiento del cáncer.