Исследователи разработали быстрый и надежный метод количественной оценки генетических частей у растений с использованием относительных единиц промотора (RPU). Этот метод решает проблемы высокой вариабельности в трансфекционных системах, особенно при трансфекции протопластов.
Исследование началось с настройки системы трансфекции протопластов мезофилла листа Arabidopsis, количественно оценивая различные нативные промоторы с использованием люциферазы светлячка (LUC) в качестве репортера. Они протестировали укороченные версии 35S-промотора, обнаружив, что версия длиной 200 пб сохраняет высокую силу, в то время как другие показывали снижение активности.
Чтобы минимизировать вариации выходов, был интегрирован модуль нормализации с β-глюкуронидазой (GUS). Это позволило получить последовательную тенденцию по всем семи промоторам и значительно снизило вариации. Однако вариации по партиям все еще оставались очевидными.
Затем исследователи представили концепцию RPU, определив значение LUC/GUS для 200-пб 35S-промотора как 1 RPU. Эта стандартизация значительно снизила экспериментальные вариации, что облегчило воспроизводимые анализы.
Чтобы расширить библиотеку генетических частей, команда разработала синтетические промоторы, которые могут быть подавлены специфическими репрессорами, что стало основой для создания NOT-ворот в проектировании генетических схем. Они оценили различные пары репрессоров-промоторов и идентифицировали те, которые обеспечили наибольший динамический диапазон.
Кроме того, исследование включало разработку сенсоров для измерения характеристик входа-выхода для генетических частей, демонстрируя способность системы строить сложные булевы генетические схемы. Исследователи успешно предсказали производительность схемы и подтвердили свои модели через in vivo приложения в растениях Arabidopsis.
Кроме того, исследование исследовало потенциал для межвидовых приложений, протестировав схемы в Nicotiana benthamiana, показывая многообещающие результаты в контроле клеточной смерти в ответ на атаки патогенов.
Этот инновационный подход к проектированию и количественной оценке генетических схем у растений может проложить путь для продвинутых приложений генетической инженерии, улучшая нашу способность манипулировать растительными чертами для улучшения сельского хозяйства.