Forscher haben eine schnelle und robuste Methode zur Quantifizierung genetischer Teile in Pflanzen unter Verwendung relativer Promotoreinheiten (RPU) etabliert. Diese Methode adressiert die Herausforderungen der hohen Variabilität in transienten Expressionssystemen, insbesondere bei der Protoplastentransfektion.
Die Studie begann mit der Einrichtung des Protoplastentransfektionssystems für das Mesophyllblatt von Arabidopsis, wobei verschiedene native Promotoren mit Feuerfliegen-Luziferase (LUC) als Reporter quantifiziert wurden. Sie testeten verkürzte Versionen des 35S-Promotors und entdeckten, dass eine 200-bp-Version hohe Stärke beibehielt, während andere eine reduzierte Aktivität aufwiesen.
Um die Ausgabeveränderungen zu minimieren, wurde ein Normalisierungsmodul mit einem β-Glucuronidase (GUS)-Protein integriert. Dies ermöglichte einen konsistenten Trend über sieben Promotoren und reduzierte die Variationen erheblich. Batchvariationen blieben jedoch offensichtlich.
Die Forscher führten dann das Konzept der RPUs ein, indem sie den LUC/GUS-Wert des 200-bp 35S-Promotors als 1 RPU definierten. Diese Standardisierung reduzierte die experimentellen Variationen erheblich und erleichterte reproduzierbare Analysen.
Um die Bibliothek genetischer Teile zu erweitern, entwarfen sie synthetische Promotoren, die von spezifischen Repressoren unterdrückt werden können, und bildeten die Grundlage für den Bau von NOT-Gattern im Design genetischer Schaltungen. Sie bewerteten verschiedene Repressor-Promotor-Paare und identifizierten diejenigen mit dem höchsten dynamischen Bereich.
Darüber hinaus umfasste die Studie die Entwicklung von Sensoren zur Messung von Eingangs-Ausgangsmerkmalen für genetische Teile, was die Fähigkeit des Systems demonstrierte, komplexe boolesche genetische Schaltungen zu konstruieren. Die Forscher sagten erfolgreich die Leistung von Schaltungen voraus und bestätigten ihre Modelle durch In-vivo-Anwendungen in Arabidopsis-Pflanzen.
Darüber hinaus erkundete die Forschung das Potenzial für interspezies Anwendungen, indem sie die Schaltungen in Nicotiana benthamiana testete, was vielversprechende Ergebnisse beim Steuern des Zelltods als Reaktion auf Pathogenangriffe zeigte.
Dieser innovative Ansatz zur Gestaltung und Quantifizierung genetischer Schaltungen in Pflanzen könnte den Weg für fortschrittliche Anwendungen der Gentechnik ebnen und unsere Fähigkeit verbessern, Pflanzeneigenschaften zur Verbesserung der Landwirtschaft zu manipulieren.